水质急性毒性/综合毒性的费希尔弧菌

Vibrio fischeri
费希尔(氏)弧菌

水质急性毒性（水质综合毒性）使用的是特殊的发光细菌来直接检测样品毒性，可监测上千种毒物的污染。DeltaTox® 对急性毒性的检测所用的发光细菌就是费希尔(氏)弧菌，或者叫 费歇尔狐细菌（Vibrio fischeri  NRRL B-11177） 。了解这种弧菌的特性，可以较好的理解水质急性（综合）毒性的分析原理，更好的开展水质急性毒性（综合毒性）的监测工作。为此，对Vibrio fischeri做一简单介绍。

Vibrio fischer概况：

费希尔(氏)弧菌是一种普遍存在于地球水环境中，在几乎所有的海洋水体里面，费氏弧菌数量都非常少，可以说是不能检测出。能发现这种弧菌的绝大多数都在亚热带水域中，而且几率很低，但在陆地及淡水区域仍可以发现其之踪迹。在某些与其组成共生关系体的深海海洋生物的发光器官中存在较高含量的费氏弧菌，或者扮演着作为海洋生物肠道等内脏的微生物丛的角色。

与其共生的海洋生物如夏威夷短尾乌贼bobtail squid可以找到大量的费氏弧菌。

夏威夷短尾乌贼(学名为“Euprymna scolopes”)与Vibrio fischeri形成共生关系，它在一个特殊的光器官内寄宿着这些细菌，可以控制照明强度和方向。但是该器官能够形成更多的光线，它所产生的神经信号能够感受到光线存在，并且其内部装载的蛋白质能够探测到光线。

Vibrio fischeri colonies on an agar plate under normal light (left) and in the dark (right), demonstrating bioluminescence production. (Credit: J. W. Hastings through E. G. Ruby)
上图左边是正常光照情况下琼脂干版上的费氏弧菌的生物发光量，右边的是黑暗条件下的生物发光量。
来源： http://www.ou.edu/cas/botany-micro/faculty/dunn.html

COVER 封面
来源于Home > Science Magazine > 12 November 2004
Development of the light organ of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes is triggered by its luminescent bacterial partner Vibrio fischerishortly after the symbiont colonizes epithelium-lined crypts deep within the organ.
夏威夷短尾乌贼的发光器官是被与其共生的费氏弧菌入侵相应的深沉上皮内衬不久后，受其触发发育形成。
In this confocal micrograph, hemocytes can be seen infiltrating the host tissue that will undergo morphogenesis.
在共聚焦显微镜下，可以看到血淋巴细胞渗入到宿主器官中并参与了形态建成过程。
See page 1186. [Image: T. Koropatnick]
具体参考：http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/306/5699/1186，图片：T. Koropatnick

自由独立存活（不和其他生物存在共生关系的）的费氏弧菌基本都是依附在水体中的有机物上，腐生生物（saprotroph）那样，通过消化腐化的有机物获得养分。

费希尔(氏)弧菌属于革兰氏阴性、杆状细菌，也属于浮游生物的一种（超微型浮游生物）；异养型生物（相对应的是自养型，绿色植物或者是硝化细菌），并可以通过鞭毛运动。

费希尔(氏)弧菌具有生物反光特性， 这种细菌对研究生物发光，细菌中的群体感应（quorum sensing，亦称为细菌的群体行为调控机制）及细菌与动物之间的共生关系等是非常关键。

This micrograph shows fluorescently stained Vibrio fischeri cells. Image taken by E Nelson and L Sycuro, provided courtesy of the Vibrio fischeri Genome Project.
这张照片就是通过荧光标记拍摄得到的费氏弧菌照片。

费希尔弧菌的科学分类

Symbiotic relationship共生关系

海洋里面自由存活的费希尔弧菌可以接种在与其存在共生关系的乌贼和鱼的幼体的发光器官当中。

发光器官里面的纤毛细胞可以有选择性的捕获共生的细菌，并且促进这些共生细菌的生长同时抑制其他类型的竞争者。细菌会在他们完全入侵了这些发光器官之后导致这些细胞的死亡。

某些乌贼的发光器官有反光蛋白质（reflectins），可以起到增强和导光的反光镜作用。这些反光蛋白质可以通过调节光度避免乌贼在月夜里往下照射之月光投下阴影，使得在其下面的獵食者便會以为该亮光是由于月光所致。

Sepolid鱿鱼每天早上都可以通过一个叫“venting（排气）”的过程排出其发光器官里面90%的共生细菌。可以认为，Venting的过程为新孵化的幼体鱿鱼提供了充足的自由存活的接种菌源。

Bioluminescence生物发光

费氏弧菌的生物发光特性是由基于种群密度的调控机制（quorum sensing）的引起的基因表达而引起的（参考文献Madigan M, Martinko J (editors) (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed. ed.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1. http://ijs.sgmjournals.org/cgi/reprint/57/12/2823）。

研究发现，这种荧光（luminescence）只有在种群密度达到一定程度的时候才能被肉眼所见。发光细菌之发光亮度与其细胞密度(cell density)有很大之相关性，那也道出：为什么海洋中有如此多之发光细菌，而不见其发光，但在发光生物的发光器中，却可发出如斯耀眼之光芒。

这一个现象可以用一个发光细菌所含之发光调节机制---lux antoinducer来解释，发光菌藉由这个机制，使其本身对其细胞密度有加以监控之能力。

其原因为：当发光细菌以free living之型态存在于海洋中时，其所能达到之细胞密度大约只有少于100cells/mL的量。所分泌出的autoinducer也被海水所稀释而无法达到肉眼所能观察到之亮度了，但在特定生物之发光器中，发光细菌之发光亮度可达1010-1011cells/mL，此时在发光器中autoinduce之浓度可达5-10nM的量。在此临界浓度以上时，细菌才会大量的转录产生发光酵素之基因，实导因于高浓度autoinducer所启动之发光调节机制。

这种荧光跟随昼夜节律（circadian rhythm）的变化而变化，也就是晚上会比白天亮一点。

另外，生物发光的水平跟防止紫外线对基因的伤害程度及费氏弧菌的致病性的生物发光两者有正相关关系。

Genetics of bioluminescence生物发光的遗传学特性

细菌的这种酶-底物（luciferin-luciferase）系统是有一系列标识为发光操纵子的基因编译而成。费氏弧菌(Vibrio fischeri)的荧光酶基因LuxCDABE已被克隆作为一种有用的信使基因。荧光酶(Luelferase)在有O₂条件下可催化还原态的FMNH2和长链脂肪醛形成氧化态的FMN和相应的长链脂肪酸，并伴随激发产生490nm波长的蓝绿色荧光。可推测的是，从发光反应的受质种类均为细胞代谢之基础代谢物来看，此发光反应的结果强弱，的确可以反映出发光菌当时生理活性的兴衰。

生物冷光(Bioluminescence)是生物体利用化学反应产生光的形式，最初的功能可能为同类间的连络或驱赶掠食者(Hastings and Morin,1991)，这些会发光的生物体包括细菌、萤火虫、昆虫、水生藻类及动物等。

所有能产生生物冷光的系统主要包括有两种物质，一种是反应基质通常被称为luciferin，另一种是催化基质产生光子的酵素也被称作luciferase。基本的生物冷光反应为luciferase 催化luciferin 的氧化而产生光和失去活性的oxyluciferin，而生物体可以利用捕食或本身合成来获得luciferin。有时候luciferin 和luciferase会键结在一起形成单一个单位称作光蛋白(photoprotein)，这类的分子在特殊离子(通常是Ca²⁺)加入系统后便会引起反应产生光。

每一种发光生物体都具有自己独特的发光系统，系统的区别在于基质和酵素的结构，虽然它们可能有共通的性质，因此依照不同luciferin 类型大致可分成四类，分别为腔肠动物冷光、细菌冷光、双鞭毛虫冷光和萤火虫冷光，但目前已被选殖出并应用于基因表现，只有细菌、萤火虫及水母的冷光基因。

细菌冷光 (Bacterial luciferase) 基因是从Vibrio 的冷光细菌Xenorhabdus 和Photobacterium genera (Szittner,1990)被选殖定序出来，命名为luxA 和luxB ，其发光机制是一种自发性(autoinduction )表现(Nealson et al.,1970)，缺点是不适合在真核宿主中表现，因需lux operon 表现，故不适合做报导基因并且灵敏度及使用方便性较差。

弧菌

革兰氏阴性、需氧和无孢子形成的菌类，广泛分布于地表水中。某些种类是病原菌（如霍乱弧菌和副溶血型弧菌）。本属细菌种类多，分布广泛,尤其是水中最为常见。形状短小,约0.5×(1～5)微米，因弯曲如弧而得名。分散排列，偶尔互相连接成S状或螺旋状。革兰氏染色阴性，菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞，无荚膜。需氧或兼性厌氧，分解葡萄糖，产酸不产气，氧化酶阳性，赖氨酸脱羧酶阳性，精氨酸水解酶阴性，嗜碱，耐盐，不耐酸。DNA中的G+C克分子含量为40～50％。

两种典型的致病弧菌：肠炎弧菌、霍乱弧菌。

其他参考资料或者参考来源：

1. Vibrio fischeri — From Wikipedia, the free encyclopedia
2. Brock Biology of Microorganisms (11th ed. ed.). Prentice Hall.
3. Vibrio fischeri — From MicrobeWiki, the student-edited microbiology resource
4. Vibrio fischeri
5. Encyclopedia > Vibrio fischeri
6. February 13th - Imaging the Dynamics of the Euprymna scolopes/Vibrio fischeri Model Symbiosis
7. http://ir.lib.ntust.edu.tw:8080/dspace/handle/987654321/3564
8. 弧菌属
9. 十大迷人发光生物
10. 王雅琴，嗜麦芽假单胞菌热休克基因dnaK启动子的亚克隆及其在大肠杆菌中功能的研究.pdf
11. 郝敏 谢波 等，含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达.pdf